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壳聚糖,壳聚糖酶

互联网 2021-07-25 11:08:22 Tags:壳聚糖

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壳聚糖酶 来源:文库 编辑:docx 时间:2021/7/25 11:08:22手机版 导读: 壳聚糖酶制剂制备工艺及其在壳寡糖生产中的应用 摘 要:利用紫外诱变产壳聚糖酶菌种,选择高产菌株进行发酵培养,同时改变发酵条件对产酶条件进行优化。结果表明:紫外照射5分钟诱变致死率为87.29%,这是最佳诱变剂量。最适发酵条件为:氮源为(NH4)2SO4,碳源为可溶性淀粉,发酵装液量为容器的35%,发酵最适温度为36摄氏度。 关键词:壳聚糖酶;壳寡糖;紫外诱变;优化Chitosanase Preparation Method and Its Application in The Production of Chi...

壳聚糖酶制剂制备工艺及其在壳寡糖生产中的应用

摘 要:利用紫外诱变产壳聚糖酶菌种,选择高产菌株进行发酵培养,同时改变发酵条件对产酶条件进行优化。结果表明:紫外照射5分钟诱变致死率为87.29%,这是最佳诱变剂量。最适发酵条件为:氮源为(NH4)2SO4,碳源为可溶性淀粉,发酵装液量为容器的35%,发酵最适温度为36摄氏度。

关键词:壳聚糖酶;壳寡糖;紫外诱变;优化

Chitosanase Preparation Method and Its Application in

The Production of Chitooligosaccharides

Abstract: Use of the UV mutagenesis production chitosanase strains, and select high-yielding strains for the fermentation, while changing the fermentation conditions to optimize the conditions for enzyme production. The results show that: the UV irradiated for 5 minutes mutagenesis lethality rate of 87.29%, which is the preferred mutagenesis dose. The optimal fermentation conditions were: nitrogen source (NH4)2SO4 carbon source for soluble starch fermentation medium volume to 35% of the container, fermentation optimum temperature of 32 degrees Celsius.

Key words: chitosanase; chitooligosaccharides; ultraviolet mutagenesis; optimization

壳聚糖(chitosanase)是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接起来的生物多糖,可在酸性溶液中溶解,反应活性比甲壳素和纤维素都高[1]。

壳聚糖是自然界中唯一的天然碱性多糖,研究发现,其降解产物壳寡糖具有良好的水溶性、易被生物机体吸收且无毒、无热源、无变异性,并具有抗癌、抑菌等生理活性,在农业、食品、医药等领域的应用广泛[2-3]。目前,在壳聚糖的降解方法中酶降解法以其降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境无污染等优点而成为壳聚糖降解的首选途径[4]。

传统的非专一性酶解法生产周期长,壳聚糖的转化率和壳寡糖的产率都低下。开发专一性的壳聚糖酶,并用以制备高品质壳寡糖产品,是开发利用我国丰富的几丁质、壳聚糖天然资源的核心问题,具有巨大的经济和社会效益[5]。本文主要研究从土壤中筛选产科聚糖酶的菌种,通过诱变育种、发酵条件优化等手段来改进传统非专一性酶解法所存在的不足之处。

1材料与方法

1.1 材料与仪器

产壳聚糖酶菌株武汉生物工程学院酶工程实验室;壳聚糖、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、琼脂、MgSO4・7H2O、NaNO3、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、尿素、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、无水乙醇均为国产分析纯;pH 5.0醋酸缓冲液、pH 8.0磷酸缓冲液、5% NaOH、无菌生理盐水、无菌水、1mol/L HCl均为武生院酶工程实验室配制。

恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、电动搅拌器、磁力搅拌器、恒温发酵摇床、梯度混合器、恒流泵、电脑紫外分光光度计、紫外分光光度计、低温离心机、喷雾干燥机、真空泵、旋转蒸发仪、冰箱、低温冷冻干燥机、试管、摇瓶、移液枪、烧杯等。

武汉生物工程学院生物工程系生物工程综合实验论文

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配方

初筛复筛培养基:10g壳聚糖溶于300ml醋酸溶液(1%)+5g (NH4)2SO4+2g K2HPO4+1g MgSO4・7H2O+20g琼脂 +700ml水

液体发酵培养基:1%(NH4)2SO4+0.5% NaCl+0.05% MgSO4・7H2O+0.07% K2HPO4+0.03% KH2PO4+0.5%酵母提取物+1.0%胶体壳聚糖+0.1%葡萄糖 1.2.2 菌种初筛

壳聚糖不溶于水,以壳聚糖为唯一碳源的平板培养基为非透明状,产科聚糖酶菌株的周围因壳聚糖被消耗而形成透明圈,测量透明圈直径和菌落直径,比值较大的菌株即为产壳聚糖酶能力较强的菌。

按照初筛培养基配制500ml,灭菌分装至平皿中,将活化的菌种用无菌水悬浮,用移液枪准确移取相同的菌悬液接种至培养皿中,32℃培养2-3天。 1.2.3 菌种复筛

初筛的菌种转移到试管斜面纯培养,就可以得到从自然界中分离的纯种野生型菌株,然后通过小型发酵实验,获取适合于工业生产的菌种。 1.2.4 培养条件优化

影响发酵的因素除菌种之外还有培养基配方,使用控制变量法通过对发酵培养基中的碳源、氮源,培养温度,装液量的改变探究最适的培养条件,从而来提高发酵的效率。

按照发酵培养基1%(NH4)2SO4+0.5% NaCl+0.05% MgSO4・7H2O+0.07% K2HPO4+0.03% KH2PO4+0.5%酵母提取物+1.0%胶体壳聚糖+0.1%葡萄糖 根据不同的培养条件分别将氮源用牛肉膏、蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NaNO3替换,碳源用葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、壳聚糖+葡萄糖替换,再另外设置温度梯度28℃、30℃、32℃、34℃、36℃,与此同时对发酵摇瓶的装液量也要进行探究,设置装液量为20%、25%、30%、35%、40%分别实验,设置实验时要保证单一变量,然后摇床发酵1周后观察实验结果。 1.2.5 标准曲线

表1:氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线制作方法 试管编号 标准溶液/ml 蒸馏水/ml DNS试剂/ml 蒸馏水/ml

0 0 2.0 1.5 6.5

1 0.2 1.8 1.5 6.5

2

0.4 1.6 1.5

沸水浴5min 冷却

6.5

3 0.8 1.2 1.5 6.5

4 1.2 0.8 1.5 6.5

5 1.6 0.4 1.5 6.5

按上表加入试剂后测OD520值,并绘制标准曲线。

酶活的单位定义为:在上述条件下,每毫升酶液每分钟产生1μmol氨基葡萄糖所需的酶活量为一个单位。 1.2.6 紫外诱变育种

将菌悬液放在培养皿中,在磁力搅拌器不断搅拌下,使用15-30W功率紫外灯管照射,照射距离为30cm左右,设置照射时间按照1-15min的紫外剂量设置7个梯度,分别为1min、3min、5min、7min、9min、11min、15min。精确计时,用移液器准确移取2%的菌悬液,pH6.0在32℃下培养72小时,摇床转速80r/min。培养完成后挑选致死率在85%-90%范围的菌落进行纯培养以获取高产菌种。

1.2.7 壳聚糖酶的分离纯化及壳寡糖的制备

盐析法:采用硫酸铵作为盐析剂,其溶解度大、价格便宜,对蛋白质沉淀的能力很强,其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来,对酶没有破坏作用。盐析时注意低温盐析,pH

1

武汉生物工程学院生物工程系生物工程综合实验论文

的调节应使酶蛋白接近其等电点。

离子交换层析法:准备层析柱,对离子交换剂进行预处理,然后用pH 8.0磷酸缓冲液平衡离子交换柱,将处理好的酶液加入层析柱,待电脑紫外分光光度计的吸光值达到峰值时加入NaCl溶液进行洗脱,收集洗脱液。洗脱液即为含有壳聚糖酶的酶液。

制备壳聚糖酶粉末:将经过超滤浓缩后的壳聚糖酶液用恒流泵泵入喷雾干燥机,在雾化器的作用下使壳聚糖酶液形成均一的细小液滴,通入的热空气和罐体内的负压状态会讲壳聚糖酶与水分离开来,分离后的酶颗粒会进入右端的旋风分离器中,在旋风分离器中实现酶与水的进一步分离。

制备壳寡糖:将超滤浓缩之后的酶液加入胶体壳聚糖中,反应1.5h后灭活,离心过滤后将上清加入旋转蒸发仪进行浓缩,浓缩至10ml左右倒入平皿,放入冰箱低温干燥,取出干燥后的粉末即为壳寡糖。

2结果与讨论

2.1 实验结果

2.1.1 紫外诱变后菌落及致死率

紫外照射处理后,培养一周发现,由于不同剂量的紫外照射,培养后的平皿上菌落数有明显的变化,如表2,我们根据表2数据绘制了致死率曲线,如图1所示。

表2:不同紫外剂量处理后菌落数与致死率统计表 时间/min 菌落数 致死率

图1:致死率曲线

0

1

3 90.67 81.33%

5 61.67 87.29%

7 40.33 91.69%

9 15.67 97.77%

11 18.33 96.22%

15 3.33 99.31%

485.33 202.67 0 58.24%

然后我们对不同剂量紫外照射后的平皿菌落进行了透明圈测量,测量数据如表3所示。

表3:不同紫外剂量处理后菌落直径与透明圈直径统计表 紫外照射时间/min

0

菌落直径d/mm

11

透明圈直径D/mm

13

D/d 1.18

2

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