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0273两个世界,Pull

互联网 2021-12-03 03:00:55 Tags:0273两个世界

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拉下实验(Pull-down assay)原理简介       拉下实验(Pull-down assay)是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外实验技术,近年来越来越受到广大研究者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。

适用场景1、用于验证两个已知蛋白的相互作用;2、筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

图 Pull-down验证蛋白互作原理图

实验流程GST-诱饵蛋白原核表达载体构建/His-猎物蛋白原核表达载体构建—原核表达—蛋白纯化—Pull-down捕获猎物蛋白—SDS-PAGE电泳—Western blot或LC-MS/MS

实验周期

拉下实验(Pull-down)的优点1、鉴定的蛋白是直接作用的蛋白,非间接作用的复合体;2、GST标记可把一些难溶蛋白变成可溶蛋白,使实验变得更易操作;3、GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强,洗脱纯度高。

拉下实验(Pull-down)的缺点1、两个非同一定位的蛋白可能因电荷或是强亲和力的原因造成假阳性,需用其他方法再次验证,例如Co-IP等;2、验证互作是在试管中进行的生化反应,不能够完全反映细胞内蛋白真实互作的状态;3、融合表达的GST标签,肽链较长,可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

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实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

交付结果1、载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌);2、载体的测序结果;3、实验报告。
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